单细胞测序服务

1.研究背景
                   异质细胞群体中的细胞多样性能够对细胞存活和增殖、对药物疗法和干预作出的反应以及很多其他的生物过程产生深刻影响。高通量单细胞转录组测序可用来研究黑色素瘤组织多样性的复杂细胞微环境。
2.方法流程
    ➀ 通过流式分选了来自于 19 个患者的 4,645 细胞进行单细胞转录组测序;每个细胞 15 万Reads 数。➁ 荧光免疫组化分析。
3.研究结果
    ➀ 单细胞转录谱区分恶性细胞和非恶性细胞的状态
        通过 CNV 分析确定为恶性的细胞,然后根据其基因表达情况进行了 TSNE 降维分析,恶性细胞分为 6 个亚型,表明了肿瘤的异质性。而非恶性细胞则相反,主要是通过细胞类型进行了区分,比如 T 细胞、 B 细胞、巨噬细胞、内皮细胞、癌相关成纤维细胞( CAFs)和 NK 细胞(图1)。

图1 恶性细胞和非恶性细胞分群结果
   ➁ 恶性细胞的分析揭示了细胞周期的异质性
       使用 G1 或 S/M 期的标志性基因来分析恶性细胞的不同亚群(图 2),该分析揭示了在肿瘤组织中,循环的细胞所占的比例平均为 13.5%;也区分低循环状态的细胞和高循环状态的细胞,比如 Mel79 处于低循环、而 Mel78 则处于高循环状态的肿瘤。 KDM5B 基因的表达与非循环状态的肿瘤有高度相关性,它在小鼠模型中编码 H3K4 组蛋白去甲基酶,这个酶与低循环相关,同时也有类似于黑色素瘤干细胞的耐药性的特征。

图2细胞所处循环状态展示图
   ➂ 非恶性细胞以及他们在黑色素瘤微环境中的相互作用
       各种各样的非恶性细胞组成了肿瘤的微环境,微环境的组成对肿瘤的发要影响。通过单细胞测序的数据区分了微环境中不同细胞的类型(图 3),包括T细胞、B 细胞、巨噬细胞、内皮细胞和肿瘤相关的成纤维细胞( CAFs),并通过特征标签揭示了这些细胞在微环境中的相对丰富程度。

图3 大量黑色素瘤细胞之间的数据拆分解揭示了细胞与细胞间的相互作用
   ➃ 肿瘤浸润性 T 淋巴细胞的多样性及其功能状态
       肿瘤浸润淋巴细胞( TILs),尤其是 CD8 + T 细胞是免疫监视的主要决定因素。单细胞测序分析来推断各种类型 T 细胞的功能,从而有助于研究对免疫检查抑制剂的肿瘤反应和抵抗(图 4):通过特征性标记定义了 T 细胞的主要亚群,比如 CD4+,Tregs, CD8+等(图 3A)。然后通过耗竭基因分析了细胞的耗竭状态,并通过免疫组化验证(图 4B 和 4C)。最后分析了细胞毒 T 细胞中耗竭 T 细胞的特征表达状态,以及高耗竭和低耗竭细胞的基因表达情况(图 4D、 E、 F),并进行了 TCR 分析(图 4G 和 H)。

图 4 T 细胞耗竭特征基因的激活依赖和非激活依赖变异
4.研究结论
    通过对黑色素瘤开展的大规模单细胞转录组测序,系统研究了肿瘤内的不同细胞亚群的组成、细胞亚群的功能以及肿瘤的微环境,为精准免疫治疗提供了参考。
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